免疫细胞疗法 [复制链接]

在现代，免疫学、分子生物学和病毒学的根本进步以及细胞制造和基因工程的技术进步导致免疫细胞疗法的发展令人振奋，T细胞疗法成为该治疗类别中最先进的疗法.肿瘤浸润性T细胞和T细胞的过继转移可表达识别肿瘤抗原的重组T细胞受体，在某些实体癌中介导了令人印象深刻的反应率，嵌合抗原受体修饰的T细胞在对所有标准药物耐药的B细胞恶性肿瘤中表现出令人印象深刻的反应，和病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)有效控制免疫功能低下宿主中的一些病毒感染（图1）。这一成功使免疫细胞疗法从研究机构的小规模研究发展成为全球商业企业。免疫生物学和合成生物学的持续进步、临床规模基因工程和基因编辑技术的快速进步以及私营部门投资的融合，使免疫细胞疗法在未来几十年对人类健康产生更大的影响。从这个角度来看，我们总结了癌症、传染病、自身免疫和其他疾病的免疫细胞疗法的现状和未来前景。

图1.用于治疗人类疾病的免疫细胞疗法

合成生物学和生物工程的最新进展扩大了免疫细胞疗法的适用性，包括癌症、感染、同种异体移植和自身免疫。CAR-T或NK细胞、工程化TCR和TIL疗法已经并将继续在血液学和实体癌中进行测试。正在开发Tregs、CAR-Tregs和CAAR-T细胞来治疗各种自身免疫性疾病并防止移植组织的排斥反应。

癌症的T细胞疗法

肿瘤浸润淋巴细胞TIL的过继转移

年代末和年代初进行的研究表明，25%–50%的转移性恶性黑色素瘤患者接受了体外扩增的自体肿瘤浸润性T细胞（肿瘤浸润性淋巴细胞[TILs]）加重组人白细胞介素的输注治疗-2(rhIL-2)经历了持久的完全缓解。这些令人印象深刻的结果是开创性的，因为它们为人类肿瘤特异性T细胞介导的免疫提供了无可辩驳的证据，并导致了作为T细胞识别癌症基础的自身抗原和新抗原的分子。

其他研究证明了淋巴细胞减少诱导的稳态细胞因子升高在支持过继转移的T细胞扩增方面的关键作用证明了淋巴细胞清除疗法是有效的过继T细胞治疗癌症方案的关键组成部分。

尽管TIL治疗在肿瘤学中的整体临床效果受到限制，部分原因是非黑色素瘤患者无法可靠地产生足够数量的生物活性TIL，但在转移性结直肠癌或乳腺癌患者接受输注富含患者特异性新抗原的TIL治疗后，也观察到了有希望的结果。。

表达工程化TCR的T细胞

基因工程的进步使研究人员能够从应答患者的TIL中克隆肿瘤反应性T细胞受体(TCR)，并在从其他癌症患者的外周血扩增的T细胞中表达TCR，为治疗应用提供了潜在的无限数量的细胞（图2）。尽管产生表达这种“工程化TCR”的T细胞在技术上是可行的，但将这种方法应用于临床的早期经验面临着一些挑战。

一个问题是转基因、肿瘤特异性TCRα和β链与内源性受体配对，这导致转基因TCR表达水平低和脱靶毒性风险。通过优化载体设计和加入半胱氨酸和/或鼠源元素进入转基因α和β链以诱导转基因蛋白质的优先配对。

图2.免疫细胞疗法的连续性

非工程化免疫细胞疗法（左）还在各种疾病背景下表现出临床疗效，包括从患者单采分离的外周Treg，这些Treg被扩增并重新注入患者体内以治疗自身免疫性疾病、GVHD或器官排斥。肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)从切除的肿瘤（通常来自黑色素瘤患者）中分离，体外扩增，并重新注入患者体内。储存的供体病毒特异性CTL被解冻、扩增并重新注入HLA匹配的受体中，用于治疗慢性感染。工程化免疫细胞疗法（右）是通过首先从患者身上提取或抽取血液，分离T细胞，然后使用病毒或非病毒方法插入编码合成受体的转基因来产生的。工程化T细胞的例子包括(1)表达由TCRα和β亚基组成的工程化TCR的T细胞；(2)表达CAR的T细胞（CAR-Ts）或NK细胞（CAR-NKs），由细胞外抗原结合结构域与参与TCR信号传导的细胞内结构域融合组成；(3)CAART细胞（CAAR-Ts），其中嵌合受体由靶向自身反应性B细胞的抗原结合结构域组成；(4)CAR-Tregs，其中Tregs从外周血中分离出来，并被设计成表达一种CAR，将它们重定向到受自身免疫性疾病影响的组织。在重新注入患者体内之前，所有工程化的T细胞类型都在体外进一步扩增。值得注意的是，经过修饰以表达CAR或TCR的T细胞主要包含细胞毒性效应物，因为目前的培养方法并未显着富集Treg。

第二个挑战是确定TIL群体中包含的用于遗传转移的安全有效的TCR。存在于黑色素瘤肿瘤中的很大一部分TIL可以识别在健康组织上低水平表达的自身抗原，强调了工程化TCR引发显着的靶向、非肿瘤毒性的潜力（见表格1）。

与识别外来抗原的TCR相比，识别自身抗原的TCR通常表现出低效力，部分与胸腺选择导致的低亲和力有关。

为了提高TCR识别肿瘤相关自身抗原的效力，研究人员使用酵母或噬菌体展示或通过用人类抗原免疫小鼠来增强它们的亲和力。亲和力增强的肿瘤反应性TCR通常表现出增强的效力，但在临床试验中，由于识别正常组织上的低水平抗原，因此会增加靶内、肿瘤外毒性的风险。亲和力增强的TCR也容易发生交叉反应，正如一项研究中发生的两起死亡事件所示，其中T细胞被设计为表达靶向黑色素瘤抗原基因(MAGE)-A3-的高亲和力TCRHLA-A*01背景下的衍生肽与心脏组织上表达的肌联蛋白发生交叉反应。在一个相关的例子中，设计用于靶向MAGE-A3的高亲和力TCR诱导了致命的神经毒性，可能是因为与脑组织中表达的MAGE-12衍生肽的交叉反应。

现在已经开发出预测工程化TCR脱靶毒性的方法，一些高亲和力的TCR证明了安全性和显着的临床活性。最值得注意的是高亲和力TCR(c)，它识别源自HLA-A2上表达的NY-ESO-1/LAGE-1的肽。大约50%的患者接受了淋巴细胞清除准备方案，然后是1-10×表达c的T细胞，有或没有rhIL-2，经历了持续的抗肿瘤作用。尽管有良好的反应率，但在大多数患者中并未观察到完全根除肿瘤，并且正在进行工作以更好地了解对这种疗法产生耐药性的基础。在自体造血干细胞移植(HSCT)后通过过继转移表达c的T细胞治疗的表达NY-ESO-1/LAGE的多发性骨髓瘤患者中也观察到了良好的临床结果。类似地，表达靶向肿瘤相关抗原WT-1的工程化TCR的T细胞表现出良好的安全性，并在HSCT后施用时在预防急性髓性白血病复发方面显示出令人印象深刻的结果。

为了克服与靶向肿瘤相关自身抗原相关的挑战，几个小组试图确定介导识别肿瘤特异性新抗原的TCR。对新抗原的免疫反应似乎在免疫检查点抑制治疗后的抗肿瘤反应中发挥重要作用，并且识别新抗原的TCR不需要亲和力成熟，预计会显示出安全的特征。表达工程化患者特异性、新抗原靶向T细胞的自体T细胞已经小规模产生，但与这种个性化方法相关的成本可能无法大规模应用。克服这一挑战的一种策略是将开发重点放在针对共享新抗原的工程化TCR疗法上。已在常见癌基因中发现了几个反复出现的“热点”突变，例如磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、Ras和p53，以及一些源自热点突变的肽在某些HLA等位基因上表达，如在结直肠癌中的KRASG12D突变和脑肿瘤中的H3K27M突变中所观察到的。此外，人们对鉴定靶向致癌融合蛋白断点区域的TCR重新产生兴趣。有可能生成一个TCR库，识别在一系列HLA等位基因上表达的肽，并使用下一代测序和主要组织相容性复合体(MHC)分型来确定适合此类治疗的患者。然而，鉴定表现出效力和特异性的TCR以及与HLA类型和肿瘤热点突变相匹配的患者比例相对较小，这限制了该策略的广泛适用性。

工程化TCR疗法的未来发展之路

结合工程化TCR的T细胞治疗剂的持续进展将需要技术来提高效力、特异性和安全性。到目前为止，开发有效且安全的TCR所需的大量努力已将此类治疗药物的可用性限制在一小组等位基因，例如HLA-A2，导致具有不太常见的HLA等位基因的患者获得治疗的重大障碍。该领域的进展正在进行中，包括最近修改TCR可变域框架区的方法，该方法可提高表达水平并增强效力，同时限制交叉反应的风险，以及新的产生从头TCR的技术或识别肿瘤反应性T细胞的抗原靶点。此外，许多工程改进正在开发中，以提高过继转移的T细胞治疗癌症的效力（图3），将这些改进整合到表达肿瘤反应性TCR的细胞中可以提高疗效。已经在临床试验中的例子包括一项测试NY-ESO-1/LAGE-1特异性TCRT细胞的试验，其中使用CRISPR/Cas9(NCT)和使用免疫检查点抑制剂(NCT和NCT)管理工程化T细胞的试验。

图3.增强过继性T细胞疗法的工程策略

复杂的生物工程方法正在开发中，以提高T细胞疗法的效力、特异性和安全性。正在开发自杀开关、门控和适配器CAR平台以减轻CAR介导的毒性。c-Jun的异位表达或NR4a因子的基因缺失赋予CART细胞衰竭抵抗力，有可能提高实体瘤的疗效并增强持久性。CART细胞还可以被设计为分泌特定因子以增强扩增或持久性（例如，IL-7、IL-12、IL-15或IL-21），减少对淋巴清除方案的需求，抵抗抑制性肿瘤微环境（例如，IL-18的分泌，截短的转化生长因子β[TGF-β]受体的表达），或充当肿瘤特异性药物递送载体（例如，抗PD-1的局部分泌）。

用于B细胞恶性肿瘤的嵌合抗原受体(CAR)T细胞

CAR将通常包含单链可变片段(scFv)的细胞外抗原靶向域与通常源自TCR的细胞内信号域相结合。表达CAR的T细胞不受MHC的限制，无论HLA类型如何，都能在患者中应用，并防止MHC下调引起的耐药性，这在癌症中很常见。现在可以很容易地获得技术来为基本上任何细胞表面分子（例如，修饰的蛋白质、脂质、糖和MHC限制性肽）生成scFv和其他结合剂，并设计具有广泛生化特性的结合剂。

包含CD28或4-1BB内域的CART细胞表现出显着的临床活性；然而，这些产品在扩张速度（CD28扩张速度更快）、峰值扩张水平（CD28扩张程度更高）和持久性倾向（4-1BB表现出更大的持久性）方面有所不同。扩增动力学和持久性的差异与临床结果相关，因为CD19.28.z-CAR在淋巴瘤中表现出最高的反应率，CAR介导的毒性较高，而CD19.BB中的CAR后复发似乎较低。用于B-ALL的z-CAR，可能是因为CAR持续至少3-6个月对于长期控制这种疾病很重要。这些观察结果强调了根据目标肿瘤的独特特征定制CART细胞构建体的潜在好处。虽然未经证实，但由于快速扩张动力学，更具侵袭性的肿瘤可能需要CD28共刺激，而那些进展较慢的肿瘤可以通过整合4-1BB共刺激的CARsT细胞更安全地控制。此外，可以优化scFv亲和力和/或CAR密度以靶向表达异质抗原水平的肿瘤或限制CAR介导的毒性（如下文更详细讨论）。

在接受表达CD19CAR的T细胞治疗的患者中观察到显着毒性，包括细胞因子释放综合征(CRS)，由此CART细胞抗肿瘤活性导致高水平的分泌性IL-6、IL-1和败血症样症状，以及与血脑屏障内皮细胞功能障碍有关的免疫效应细胞相关神经毒性综合征(ICANS)由高炎症环境诱导。尽管这些毒性导致了严重甚至致命的并发症，但降低CART细胞剂量、使用类固醇疗法或阻断IL-6R的抗体（即托珠单抗）治疗一直非常有效。值得注意的是，大型多中心试验中的治疗相关死亡率目前低于5%，这与针对这些难治性疾病的其他标准治疗方案没有什么不同。其他药理学策略，如抗IL1受体阻断或酪氨酸激酶抑制性达沙替尼，可有效且可逆地抑制CART细胞功能，已经在临床前模型中进行了测试，可以为标准CRS管理疗法难治的患者提供现成的、美国食品和药物管理局(FDA)批准的替代方案。工程安全开关，例如诱导型半胱天冬酶9，可以在严重毒性的情况下消耗CART细胞，但本质上是不可逆的，尚未经过临床测试.结合源自单纯疱疹病毒的胸苷激酶的替代自杀开关引发了免疫原性反应，导致过继转移的T细胞存活率降低，这说明外源蛋白工程化表达后免疫原性增强的潜在风险。

CD19靶向CAR的临床成功获得了FDA和欧洲药品管理局的批准，并引发了学术界和私营部门对CART细胞研究的广泛投资，包括针对B细胞恶性肿瘤的其他靶点开发CART细胞。CD22靶向CAR在ALL患者中也表现出显着的成功，超过80%的患者在接受最高剂量水平治疗后达到完全缓解，而B细胞成熟抗原（BCMA）靶向CAR诱导高比例的多发性骨髓瘤患者获得缓解。观察到的针对B细胞恶性肿瘤的CART细胞的高反应率是前所未有的，特别是考虑到大多数接受这些药物治疗的患者对所有其他疗法都无效。

用于非血液学实体瘤的CART细胞与在B细胞恶性肿瘤中观察到的成功形成鲜明对比的是，CART细胞在实体瘤患者中没有表现出令人信服的活性证据。当前的概念认为，这可能代表了几个障碍的融合。一个主要挑战是缺乏在实体瘤上高水平、均一表达而在正常组织上表达有限的已鉴定细胞膜靶点。然而，随着研究人员更加专注于对癌症表面组进行编目，已经确定了具有显着差异表达的分子，包括腺癌上MUC1的Tn糖型、弥漫性内在性脑桥胶质瘤上的GD2神经节苷脂、神经母细胞瘤上的GPC2和尤文肉瘤上的PAPP-A。这些结果，再加上对CAR需要高水平抗原密度才能实现最佳激活的新认识以及该工程一，乐观地认为CART细胞靶向实体瘤上过表达的细胞表面分子的治疗窗口可以被确定。

一个相关的问题是一般癌症，尤其是实体瘤上抗原表达的异质性，这激发了开发多特异性CAR的兴趣，如下所述（图3）。细胞疗法对实体瘤的有效治疗也可能受到有限的贩运的阻碍。最近的工作表明，区域递送可以减轻CNS肿瘤和其他癌症（例如间皮瘤）的这一挑战，这些癌症主要表现出区域扩散。最后，众所周知，实体癌具有抑制性微环境，它通过多种途径抑制CART细胞功能，包括检查点受体配体（例如PD-L1）的表达、缺氧和营养消耗以及抑制性免疫细胞（例如，调节性免疫细胞）。T细胞[Tregs]、髓源性抑制细胞[MDSCs]）。如下所述，许多工程方法正在开发中，以应对这些挑战并增强CART细胞对实体瘤的效力（图3）。

传染病的T细胞疗法

病毒特异性T细胞疗法

年代初期的临床研究人员观察到，一些在异基因造血干细胞移植后白血病复发的患者在输注来自供体的T细胞后可能会缓解。这些数据最终为T细胞介导的抗白血病作用以及此类细胞治疗不受控制的病毒感染的潜力提供了令人信服的证据，这种情况在这种情况下并不少见。在严重免疫抑制的患者中，同种异体病毒特异性CTL对EBV感染和EBV相关淋巴瘤、巨细胞病毒、腺病毒、BK病毒和人类疱疹病毒6感染的反应率非常高，移植的证据有限尽管使用了最低限度的MHC匹配产品。由于受体免疫功能不全，疗效取决于对同种异体细胞的有限排斥，而GVHD的缺失可能是由于缺乏幼稚T细胞的CTL产品的同种异体反应性有限。“现成的”病毒特异性CTL库现在可用于治疗涵盖绝大多数HLA等位基因的多种病毒，因此可能为大多数患者提供合适的产品（图2)，私人投资正在寻求将这种疗法商业化。这些产品的成功也提高了使用病毒特异性CTL靶向病毒相关癌症的前景，包括由EBV驱动的癌症等。然而，由于病毒相关癌症患者保留了足够的免疫力来排斥同种异体细胞产物，这些努力主要集中在自体病毒特异性CTL或基因工程病毒反应性TCR的过继转移上，因此，与之前讨论的方法没有什么不同利用非病毒定向T细胞进行癌症治疗。

用于HIV感染的病毒特异性CART细胞

从年开始，针对HIV感染的CART细胞临床试验启动。T细胞被设计为表达第一代CAR，利用CD4外域识别HIVEnv蛋白的gp亚基作为其抗原结合域，从而能够识别HIV感染的细胞。这些试验并未证明在控制HIV感染方面有效，但由于抗逆转录病毒治疗药物的同时发展，许多患者表现出长期存活。值得注意的是，输注后10年以上测试的样本中有98%显示了持久性CART细胞的证据，没有证据表明载体在癌基因附近整合的细胞持续克隆扩增或富集，也没有证据表明存在持续性克隆扩增或细胞富集。任何有复制能力的逆转录病毒/慢病毒出现的证据。经过多年的随访，这一经验是迄今为止最有力的证据，证明过继转移逆转录病毒工程T细胞是安全的，并且此类细胞或其后代能够持续存在十年以上。

正在进行许多努力以提高HIV特异性CART细胞的功效，其中许多与增强CAR对癌症的功能的努力重叠，包括增强CART细胞的持久性和工程化多-克服病毒异质性的特异性。然而，一些挑战与用于HIV感染的CAR独特相关，包括需要在工程化T细胞本身中设计对病毒感染的抗性，研究人员正在尝试通过CCR5的基因编辑和干扰病毒机制的蛋白质的过度表达。由于与淋巴细胞清除方案相关的毒性在这种临床环境中不太可能被接受，并且由于CAR生物活性必须持续多年，因此工程细胞以确保长期持久性是一个主要焦点。在一个灵长类动物模型中，与从血液中产生的那些相比，由HSC产生的猿猴免疫缺陷病毒(SIV)反应性CART细胞在停止抗逆转录病毒治疗后表现出更强的持久性和对病毒血症反弹的保护，这提高了HSC衍生的表达CAR的T细胞的前景在这种情况下，细胞可能是首选。通过共同表达CXCR5，将HIV特异性CART细胞与淋巴组织B细胞滤泡中的CD4+T滤泡辅助(Tfh)细胞共表达，靶向HIV潜伏库的工作也在进行中（图3）。

自身免疫和其他疾病的T细胞疗法

尽管在过去几十年中引入了用于自身免疫的改进治疗剂，但仍需取得更多进展。小分子酪氨酸激酶抑制剂和细胞因子靶向抗体显示出显着的临床疗效，但具有广泛的免疫抑制作用，不适用于全谱自身免疫性疾病。这些挑战促使人们努力开发更有针对性的方法，例如Treg的过继转移（图2），这在保持自我耐受、维持免疫稳态和预防自身免疫方面发挥着重要作用。非工程化Treg的过继转移在各种自身免疫和GVHD的小鼠模型中产生了令人印象深刻的结果，以及在GVHD、器官移植和I型糖尿病（T1D)已被证明是安全可行的，并已证明在输注后长达1年的持久性（图1）。然而，这些疗法的近期和长期疗效仍未得到证实。

CAR正在Treg中表达，作为提高Treg疗法效力和特异性的策略。在一项具有里程碑意义的研究中，研究人员在结肠炎小鼠模型中设计了特异性针对2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)的CARTreg。CARTregs以抗原特异性方式分泌抑制因子、增殖和改善疾病症状。在多发性硬化和移植排斥的小鼠模型中观察到类似的结果。CARTregs在非工程化Tregs次优剂量下表现出治疗效果，提供证据表明CAR表达除了增强特异性之外还提高了Treg疗法的效力。总的来说，这些研究为CARTreg疗法的临床测试提供了强有力的理论依据。

CARTreg疗法相对于效应CART细胞疗法的一个潜在优势是目标群体的维持，这可能导致目标组织中的Treg持续扩增、持久性和持久的免疫抑制。此外，尽管效应CART细胞疗法的脱靶毒性可能导致严重的组织损伤，但预计CARTregs的脱靶效应不那么严重，可能包括对非患病组织的长期免疫抑制、机会性感染或抑制局部肿瘤免疫。如果Treg表达一种表现出不依赖抗原的强直信号的CAR，也可能出现类似的副作用，导致组成性和非特异性免疫抑制。

与CARTreg相关的一个明显安全风险与Treg谱系的潜在可塑性有关。在T1D的小鼠模型中，原位暴露于炎症条件下的Treg失去了FOXP3的表达并转化为效应样T细胞。此外，包含4-1BB共刺激结构域的CARTreg转化为缺乏免疫抑制能力的细胞毒性CART细胞，提高了将工程化Treg转化为效应细胞可以增强自身免疫而不是抑制自身免疫的前景.如果CARTreg制造的产品中存在效应CART细胞污染，则可能会出现类似的现象。鉴于与Tregs相比，效应T细胞在激活时扩增得更快、更稳健，一小群效应CART细胞可以迅速胜过CARTregs并介导破坏性的自身免疫。

细胞工程和合成生物学为减轻此类毒性提供了潜在机会（图3）。除了效应CART细胞中使用的药物诱导性自杀开关之外，一种在FOXP3表达缺失或响应炎性细胞因子转录时自主激活的细胞内在自杀开关可以帮助保护CARTreg转换。或者，CARTregs中FOXP3的异位表达可以通过维持FOXP3表达和促进抑制功能来减轻转化。为了防止肿瘤免疫的长期免疫抑制或靶组织部位的机会性感染，可以采用可调平台，其中CAR活性取决于注入患者体内的蛋白质治疗剂。在表现出突然和严重症状（即突发）时期的自身免疫性疾病中，如类风湿性关节炎或复发缓解型多发性硬化症，此类平台可以仅在这些时期诱导CARTreg活性，同时在疾病症状出现时保持CARTreg休眠最小。

最近，研究人员通过使用一种创造性的策略开发了嵌合自身抗体受体(CAAR)，以利用效应CART细胞来治疗自身免疫性疾病（图1）。CAARs类似于典型的CARs，除了细胞外抗原结合结构域针对自反应B细胞的B细胞受体(BCR)。研究人员利用了寻常型天疱疮的鼠类模型，其中靶向桥粒芯蛋白的自反应B细胞介导了皮肤损伤。表达具有桥粒芯蛋白3胞外域的CAAR的T细胞特异性靶向致病性B细胞，从而治愈。该研究提供了重要的概念证明，即CAART细胞可用于B细胞介导的自身免疫性疾病，其中特定的自身抗原是明确定义的，如类风湿性关节炎和红斑狼疮。

最近的一项具有挑战性的报告利用靶向成纤维细胞激活蛋白(FAP)的CART细胞来预防纤维化诱导的心肌病小鼠模型中的纤维化。在4周内诱导纤维化，并在诱导刺激后1周给予CART细胞。CART细胞浸润心脏，诱导活性成纤维细胞被杀死，减少纤维化，从而改善心脏功能。在12周内未观察到明显的毒性，这可能反映了发炎心脏组织内成纤维细胞上表达的高水平FAP与正常组织中成纤维细胞上表达的低水平FAP之间的治疗窗口。在人类纤维化疾病的背景下是否可以确定这种时间依赖性和抗原依赖性治疗窗口仍有待观察，但这项研究证明了CART细胞治疗多种人类疾病的多功能性，肯定会成为一个领域未来的研究。

解决主要障碍的下一代工程

基因工程、基因编辑、细胞重编程和合成生物学的进步提供了一个越来越强大的工具箱，可以用来设计解决目前限制该领域的耐药性和毒性问题的解决方案。这些解决方案中的许多都是模块化的，并且有可能以多种方式集成到单个细胞和细胞产品中，从而显着提高免疫细胞治疗剂的复杂性。

用单特异性CART细胞治疗后抗原阴性和抗原低逃逸

与肿瘤学或传染病（如结核病或艾滋病毒）中的其他靶向治疗类似，对任何一个靶标的选择性压力通常会导致逃逸变异的出现。毫不奇怪，抗原丢失代表了对CART细胞疗法的主要抗性形式。一个相关的问题是人们越来越认识到，与可以识别极低水平抗原的TCR治疗剂相比，最佳CART细胞激活需要高水平的抗原。尽管这种特性可以为靶向在正常组织中低表达的抗原（例如GD2神经节苷脂或间皮素）提供治疗窗口，但正如临床试验所观察到的，通过选择具有亚阈值水平的靶向抗原的变体，也可能发生对CAR疗法的抗性CD22-CAR。为了解决这些问题，正在努力设计有效的多特异性CART细胞（下文讨论；图3），通过改变scFv亲和力来调节CART细胞活化的抗原密度阈值、上调靶细胞上的抗原密度、靶向组织基质以防止变异肿瘤细胞逃逸，或工程方法来增强自然免疫的诱导，从而扩大CAR诱导的免疫反应以包括旁观者、抗原丢失变体。

赋予多重特异性以提高疗效（或门）

程组合抗原识别可以通过克服抗原逃逸和/或增加可靶向抗原的库来提高CART细胞的功效（图3）。施用多种CART细胞产品是多抗原靶向的一种策略。然而，这种方法显着增加了成本和劳动力。此外，在临床前模型中，这种方法不如将多特异性识别工程化到单个细胞中有效，并且在迄今为止唯一报告的临床试验中，反应率类似于接受单一CART细胞产品治疗的患者。正在开发几种方法来设计能够靶向两种抗原的单个细胞，其中任一抗原的结合都会触发CART细胞激活（布尔逻辑中的“OR”门）。一种方法是用编码两个CAR的载体共同转导单个T细胞群，而相关方法结合双顺反子载体以在每个细胞上表达两个单独的嵌合受体。

另一种方法是创建二价或“串联”构建体，其中通过CAR细胞外部分上的两个结合域中的任何一个识别抗原可以触发效应子功能。年报道了一种用于治疗胶质母细胞瘤的HER2/IL13Rα2串联CAR，并观察到对抗原逃逸的保护以及当两种抗原都存在时对CART细胞活化的协同作用。在临床前模型和临床模型中开发和研究了许多串联CARCD19/20和CD19/22CAR治疗淋巴瘤和CD19/22CAR治疗白血病的试验正在进行中。有趣的是，所有串联CAR设计都需要对各种配置进行系统测试，以确定每种抗原的最佳设计。例如，CD19/20CAR需要测试特异性之间不同长度的接头，其中只有短接头保留功能，而最佳CD19/22CAR需要一个环状结构，其中两个可变区CD19成分散布在CD22结合成分的可变区中。

双靶点或多靶点ORCAR也可以使用所谓的“适配器”CAR生成，该CAR具有可以结合多种不同抗原特异性的结合物的胞外域（图3）。必须使用可溶性适配器才能激活CART细胞，当同时使用多个结合剂时，可以实现OR门控。这种平台理论上提供了一个安全开关，因为CART细胞功能被可溶性适配器的清除所消融。调节CAR活性的能力不仅取决于T细胞扩增和持久性的动力学，还取决于赋予抗原特异性的衔接蛋白的半衰期和稳定性。另一种方法涉及改造CART细胞以分泌一种双特异性抗体样分子，该分子在一端触发T细胞活化，并在另一端结合肿瘤上的第二种抗原。这种方法最近在胶质母细胞瘤的背景下是首创的，其中针对致癌肿瘤抗原EGFR变体III的CART细胞也分泌靶向EGFR的双特异性分子。

增强安全性的“AND”和“NOT”门控策略

CART细胞也可以设计为仅在响应同时表达两种抗原的靶细胞时激活，从而能够区分表达抗原对的肿瘤细胞与仅表达一种靶标的健康组织（图3）。在一种策略中，一种受体结合了CD3zeta内结构域，而另一种结合了共刺激结构域。为了防止OR门，必须将包含CD3zeta的CAR设计为具有非常低的亲和力，以便在抗原结合时仅诱导低于标准的激活。一种不同的方法涉及使用合成的Notch(synNotch)受体，其中synNotch受体对抗原1的感应诱导对抗原2具有特异性的CAR转录。这种策略在解剖学上分离的实体瘤的临床前模型的背景下是有效的，其中一个表达两种抗原的肿瘤被移植到一侧，而仅表达一种抗原的第二个（对照）肿瘤被移植到第二侧。然而，在液体肿瘤模型中，表达抗原1(ROR1)的正常基质与表达抗原1(ROR1)和抗原2（EpCAM或B7-H3）的肿瘤细胞在解剖学上混合在一起，synNotch逻辑门未能幸免于难仅表达抗原1的健康细胞。一些研究人员还试图通过在CAR靶向抗原2上结合CTLA-4或更有效的PD1的细胞内结构域来开发非门，其中抗原1仅在没有抗原2的情况下被靶向。这已被证明在成纤维细胞同种异体排斥的临床前模型中是有效的，但尚未进入临床试验。

针对T细胞耗竭和肿瘤微环境以增强效力

慢性抗原刺激导致T细胞耗竭状态，以功能障碍为特征；多种抑制性受体的表面表达，包括PD-1、TIM-3和LAG-3等；以及独特的转录和表观遗传谱有充分的临床前和临床证据表明CART细胞易耗竭，这限制了疗效。与表现出完全反应(CR)的患者相比，肿瘤浸润CD19CART细胞的典型耗竭标志物在无反应者中更高，并且发现CART制造产品上的高耗竭标记物表达可预测无反应。由细胞膜中CAR受体的抗原非依赖性聚集或暴露于高肿瘤负荷引起的强直信号现象也可能导致精疲力竭。如果在工程化之前存在耗尽的T细胞，在基因操作之前选择具有更大增殖能力的T细胞亚群可以改善结果。有趣的是，临床前和临床研究表明，达沙替尼或依鲁替尼等小分子药物可以预防或逆转T细胞耗竭。最后，通过调节CAR蛋白对强直CAR信号的瞬时破坏可以表观遗传重编程耗尽的CART细胞并增强临床前模型的功效。

最近的一项案例研究报告了单个T细胞克隆的富集，其中CAR转基因整合到TET2基因座中，导致功能丧失突变。这种突变赋予CART细胞更高的效力、扩增、持久性和类似记忆的表型，最终导致在报告时的5年完全缓解，提高了CART的前景可以设计细胞来避免或抵抗衰竭（图3）。这已成为该领域一个活跃和有前途的研究领域。CAR转基因插入TRAC基因座和CAR表达的内源性控制防止了临床前白血病模型的衰竭。转录因子c-Jun的过度表达已被证明可以保护T细胞免受最累人的CAR设计的影响。在鼠类模型中，核受体转录因子NR4A1、NR4A2和NR4A3的表达也与CART细胞耗竭有关，但没有这些药物的可用抑制剂，尚不清楚如何将这种策略应用于人类T细胞，其中3个单独的基因需要敲除。

许多改变肿瘤微环境或赋予CART细胞抗性的方法也在研究中。一些团队专注于通过工程化分泌抗PD1纳米抗体、基因编辑以完全删除PD-1蛋白或设计一种“开关”受体，由与CD28等共刺激分子的细胞内结构域融合的细胞外PD-1组成，可将肿瘤PD-L1诱导的抑制信号转化为激活信号。类似地，为了克服肿瘤过度表达Fas配体所施加的死亡信号，研究人员表达了一种显性失活Fas受体，该受体使靶向CD19的CART细胞的扩增和持久性增加。Brentjens发表了一系列关于“装甲”CART细胞的出版物，其中第二个转基因旨在改变肿瘤环境；这包括炎性细胞因子IL-12或IL-18或CD40L的分泌，以增强抗原交叉呈递并促进表位扩散。其他小组也使用了转化生长因子β(TGF-β)受体的非信号形式，由于其组成型和高表达，该受体胜过内源性受体。该转基因首先应用于人类EBV特异性T细胞，然后作为第二个转基因包含在临床前模型和临床试验中靶向前列腺癌的人类CART细胞中(NCT)。最后，临床前模型表明，靶向肿瘤基质和/或脉管系统可以增强CAR-T的功效并可能限制抗原阴性变异的逃逸。

替代免疫细胞（自然杀伤[NK]细胞、γ-δ[γδ]细胞、NKT[NKT]细胞和诱导多能干细胞[iPSC]衍生的免疫效应细胞）和同种异体免疫细胞疗法

尽管这篇综述主要集中在管理和改造αβT细胞的疗法上，但有一项新兴工作表明在使用类似技术来改造其他免疫效应细胞方面取得了进展，这些细胞可以赋予某些优势。NK、γδT细胞和NKT细胞的主要优点是它们都具有细胞毒性能力，但都不表达内源性TCR；因此，当给予MHC不匹配的宿主时，它们不会介导GVHD。然而，成人外周血NK细胞对逆转录病毒和慢病毒转导具有相对抗性，并且在缺乏高水平IL-2或IL-15的情况下表现出较差的持久性。为了避免这种情况，开创了一种方法，通过这种方法，包含在无关脐带血中的NK细胞被转导以表达CD19靶向CAR和编码IL-15的转基因，其中最近的一份报告显示，接受这种疗法的11名患者中有7名介导了CR。这种方法可以提供现成的CAR-NK细胞产品，从而实现CAR-NK治疗的前所未有的规模化。γδT细胞是外周血中的罕见群体，在离体培养过程中需要大量富集和双膦酸盐（Xiao等，）。尽管如此，研究人员已经成功地用CARs转导了γδT细胞，这些细胞在临床前模型中表现出活性。同样，不变的NKT细胞是非常罕见的群体，但在实体瘤中表现出临床前疗效，并且当它们被设计为分泌IL-15时显示出增强的持久性。

从iPSC生成免疫效应细胞的改进方法正在出现，进一步开启了工程化免疫细胞群可扩展性的潜力。目前尚不清楚iPSC衍生细胞与成熟αβT细胞工程化的细胞产品相比如何表现出细胞毒性和持久性，以及是否可以使用人工细胞培养系统产生临床相关的细胞数量；然而，产生和提供有效的iPSC衍生的工程免疫效应细胞的成功方法为从取之不尽的来源制造数百剂治疗细胞提供了诱人的可能性。

这种方法成功的主要障碍是拒绝同种异体产品。不过，这方面正在取得进展。最近的初步报告已经证明了设计用于删除TCR和CD52的同种异体CART细胞的可行性和一些临床活性，能够选择性地去除宿主中的淋巴细胞以使用CD52导向的mAb防止排斥。最近还报道了通过删除HLAI类和II类结合CD47过表达来减少排斥的。如果可以克服GVHD和排斥的双重挑战，健康供体产生的免疫效应细胞库的可用性可以通过实现更具成本效益的疗法来改变免疫细胞疗法的领域，减少向患病者提供此类疗法所需的时间。患者，为更复杂的多工程提供平台，并实现跨产品的质量标准化，超出了使用自体平台所能完成的。

免疫细胞疗法是一类迅速崛起的治疗剂，FDA批准了CART细胞疗法用于治疗B细胞恶性肿瘤，取得了显着进展，但事实证明，将其转化为实体瘤极具挑战性，而且这些治疗药物对其他疾病的影响有限。利用基因缺失、转录因子异位过表达、多特异性结合剂、布尔门控和其他合成系统的复杂生物工程方法将最终决定下一代免疫细胞疗法在多大程度上成为传统药物的有效替代品。